维甲酸诱导MESPU35胚胎干细胞系定向分化神经细胞的佳条件

摘要：背景:神经轴突再生是治疗中枢神经系统损伤必须克服的困难之一,包括移植神经干细胞、胚胎干细胞和许旺细胞等在内的细胞移植疗法已取得显著疗效,然而供体细胞不足的瓶颈限制了其发展.目的:观察维甲酸诱导MESPU35胚胎干细胞分化过程,找到其佳分化为神经细胞的条件.设计:非随机对照实验.单位:解放军第三军医大学组织胚胎学教研室.材料:实验于2000-01/05在解放军第三军医大学基础部组织胚胎学教研室完成.发情期昆明种小鼠18只,雌12只,雄6只,2:1同笼交配,阴栓检出日记为受孕1d.MESPU35胚胎干细胞株.方法:孕13～16 d的小鼠胚胎,去头,胸腹腔脏器及四肢后,制备饲养层细胞.①采用饲养层贴壁培养增殖MESPU35胚胎干细胞,经典4-/4+法(即拟胚体自然生长4 d,不加维甲酸,随后4 d添加维甲酸诱导形成高比例神经拟胚体的方法)诱导其神经定向分化,不同浓度血清培养拟胚体,相差显微镜观察不同血清浓度下神经样拟胚体并计数.②免疫细胞化学技术观察各个分化时相点(5,9,14 d)和不同维甲酸浓度下分化细胞形态学特征,流式细胞仪计数分化神经细胞比例.主要观察指标:①维甲酸诱导MESPU35胚胎干细胞分化后神经拟胚体形成中突起和细胞体长度估计测量.②免疫细胞化学染色分化细胞形态观察及流式细胞仪测量分化细胞比例.结果:①相差显微镜观察发现不同血清浓度对拟胚体形成后神经定向分化有一定影响,血清浓度过高和过低降低了拟胚体神经分化比例,5%血清浓度分化比例高.②免疫细胞化学观察维甲酸诱导MESPU 35胚胎干细胞分化形成的NF 200阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例随分化时相点和维甲酸浓度升高而升高,NF 200阳性细胞形态由无突起变为多极细胞,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞突起由短变长,后联结成网状.③流式细胞仪检测分化产生的胶质纤维酸性蛋白、NF 200阳性细胞比例变化类似免疫细胞化学.结论:维甲酸配合合适的血清浓度、分化时相点等条件能够诱导MESPU 35胚胎干细胞高比例神经分化,其分化调节以浓度依赖模式和时间依赖模式进行.是治疗中枢神经系统损伤必须克服的困难之一,包括移植神经干细胞、胚胎干细胞和许旺细胞等在内的细胞移植疗法已取得显著疗效,然而供体细胞不足的瓶颈限制了其发展.目的:观察维甲酸诱导MESPU35胚胎干细胞分化过程,找到其佳分化为神经细胞的条件.设计:非随机对照实验.单位:解放军第三军医大学组织胚胎学教研室.材料:实验于2000-01/05在解放军第三军医大学基础部组织胚胎学教研室完成.发情期昆明种小鼠18只,雌12只,雄6只,2:1同笼交配,阴栓检出日记为受孕1d.MESPU35胚胎干细胞株.方法:孕13～16 d的小鼠胚胎,去头,胸腹腔脏器及四肢后,制备饲养层细胞.①采用饲养层贴壁培养增殖MESPU35胚胎干细胞,经典4-/4+法(即拟胚体自然生长4 d,不加维甲酸,随后4 d添加维甲酸诱导形成高比例神经拟胚体的方法)诱导其神经定向分化,不同浓度血清培养拟胚体,相差显微镜观察不同血清浓度下神经样拟胚体并计数.②免疫细胞化学技术观察各个分化时相点(5,9,14 d)和不同维甲酸浓度下分化细胞形态学特征,流式细胞仪计数分化神经细胞比例.主要观察指标:①维甲酸诱导MESPU35胚胎干细胞分化后神经拟胚体形成中突起和细胞体长度估计测量.②免疫细胞化学染色分化细胞形态观察及流式细胞仪测量分化细胞比例.结果:①相差显微镜观察发现不同血清浓度对拟胚体形成后神经定向分化有一定影响,血清浓度过高和过低降低了拟胚体神经分化比例,5%血清浓度分化比例高.②免疫细胞化学观察维甲酸诱导MESPU 35胚胎干细胞分化形成的NF 200阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例随分化时相点和维甲酸浓度升高而升高,NF 200阳性细胞形态由无突起变为多极细胞,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞突起由短变长,后联结成网状. ③流式细胞仪检测分化产生的胶质纤维酸性蛋白、NF 200阳性细胞比例变化类似免疫细胞化学.结论:维甲酸配合合适的血清浓度、分化时相点等条件能够诱导MESPU 35胚胎干细胞高比例神经分化,其分化调节以浓度依赖模式和时间依赖模式进行.